از زمان اختراع میکروسکوپ های نوری در اواخر قرن شانزدهم میلادی تاکنون، این ابزارها بسیار پیشرفت کرده اند و به دانش کلی ما در زمینه های مختلف زیست شناسی و پزشکی افزوده اند. میکروسکوپ ها می توانند تصاویر را تا هزاران برابر بزرگ کرده و جزئیات ریزشان را نمایش دهند.
دانش و فناوری میکروسکوپی نوری از زمان ابداع اولین میکروسکوپ توسط رابرت هوک و آنتونی فن لیونهوک بسیار تغییر کرده و مدرن تر شده است. تکنیک های ویژه و دانش نورشناسی به انسان کمک کردند تا با ساختارهای ویژه بیوشیمیایی درون سلول های زنده آشنا شوند.
میکروسکوپ ها حتی حالا وارد دوره دیجیتالی هم شده اند. با بهره گیری از دوربین های دیجیتال و دستگاه های بار جفت شده (CCD ها)، میکروسکوپ ها حالا می توانند از نمای زیر لنزها عکسبرداری نیز انجام دهند. با این حال، بیس و پایه میکروسکوپ ها همانی است که چند صد سال پیش به کار برده شد و این روزها در کلاس های عملی زیست شناسی یاد می گیریم.
نحوه کارکرد میکروسکوپ بسیار شبیه به یک تلسکوپ است که برای مشاهده ستاره ها از آن استفاده می کنیم. اما چندین تغییر کوچک سبب شده تا تفاوتی عظیم میان این دو دستگاه پدید آید.
یک تلسکوپ باید مقادیر بسیاری از نور ساطع شده توسط اجسام دور را در گستره وسیعی از تاریکی کهکشان جمع کند. بنا به همین دلیل، تلسکوپ نیازمند لنزهای آبژکتیو بزرگ است. چون لنزهای آبژکتیو بزرگ هستند، تلسکوپ تصویر شیء را در نقطه کانونی دوری نمایش می دهد که به همین دلیل، تلسکوپ ها بسیار طویل هستند. سپس، بخش انتهایی تلسکوپ که جلوی چشم انسان قرار می گیرد، تصویر را پیش چشم بزرگ نمایش می دهد.
برخلاف تلسکوپ، یک میکروسکوپ، نور را از محیطی بسیار محدود شده و باریک که به شکلی قابل قبول نورانی شده جمع می کند. نمونه زیر لنزهای آبژکتیو قرار گرفته و نور به میزان کافی از درون آن گذر می کند. به جای تصویربرداری از اجسامی عظیم که میلیون ها کیلومتر با ما فاصله دارند، تلسکوپ از جسمی که تنها چند میلیمتر از آن فاصله گرفته نور را دریافت می کند.
میکروسکوپ زمینه روشن – ساقه گیاه تک لپه
در عوض، لنزهای آبژکتیو میکروسکوپ هم بسیار کوچک و کروی هستند. کوچک و کروی بودن لنزها سبب کاهش فاصله نقطه کانونی خواهند شد (برعکس تلسکوپ)، به همین دلیل میکروسکوپ بسیار کوچک است. سپس، تصویر گرفته شده از لنزهای آبژکتیو توسط قطعه ای دیگر به نام لنزهای چشمی بزرگ می شود.
اختلاف بزرگ بعدی میان تلسکوپ و میکروسکوپ، وجود منبع نوری و کاندنسور در میکروسکوپ است. واضح است که منبع نوری وظیفه روشن کردن نمونه زیر میکروسکوپ را به عهده دارد اما کاندنسور می تواند میزان ورود نور را کنترل کند. بسته به نوع و ضخامت نمونه، می توان دریچه قرار گرفته در بالای منبع نوری و زیر نمونه را باز یا بسته کرد، تا ورود نور را کنترل کرد.
مورد بعدی اینکه، تلسکوپ لنز ثابت آبژکتیو و لنزهای قابل تعویض چشمی دارد اما میکروسکوپ دقیقا در نقطه مقابل، لنزهای قابل تعویض آبژکتیو و لنز ثابت چشمی دارد. با تغییر لنزها، می توان میزان بزرگنمایی را کنترل کرد.
یک میکروسکوپ نوری، چه مدل های ساده دانش آموزی و چه مدل های پیشرفته که در آزمایشگاه های تحقیقاتی وجود دارند، باید اجزای زیر را داشته باشند:
سیستم کنترل نمونه: این بخش از نمونه وظیفه محکم نگه داشتن نمونه را در سر جای خود دارد. گیره ها لام را محکم در بر می گیرند تا تکانی متوجه حال آن نشود. در کنار لام، تکه های آهنی خط کش مانندی قرار گرفته اند که درجه هایی روی آن مشخص شده.
با استفاده از این اعداد و ارقام می توان جایگاه عکس در نمونه را ثبت کرد تا نمایش آن زیر میکروسکوپ دیگری سریع تر شود. در واقع این خط کش ها، آدرس تصویر در نمونه را به محقق می دهند. نمونه روی استیج قرار می گیرد و در مرکز استیج، یک حفره وجود دارد تا نور از آن عبور کرده و زیر نمونه بخورد. بسته به نوع میکروسکوپ، یک، دو یا چند پیچ، میزان حرکت عمودی استیج را کنترل می کنند.
سیستم روشنایی: منبع نور و کندانسور مهم ترین بخش های سیستم روشنایی هستند. منبع نور یک چراغ پر قدرت است که شدت نور آن کم و زیاد می شود و کندانسور در بالا آن قرار گرفته تا میزان نور ورودی را کنترل کند.
لنزها: دو نوع لنز در بالا و پایین لوله اصلی قرار گرفته اند. یک الی چند لنز آبژکتیو در قسمت انتهایی برای تنظیم میزان بزرگنمایی و یک لنز چشمی یا آکولار برای مشاهده تصویر زیر میکروسکوپ.
فوکوس: روی بدنه میکروسکوپ، معمولا دو پیچ قرار گرفته که هر کدام با سرعتی خاص استیج را بالا و پایین می برند. این دو پیچ برای تنظیم لنزها و نمونه و قرارگیری آن ها در فاصله کانونی درست بسیار موثرند.
قسمت های پشتیبانی کننده: میکروسکوپ ها عمدتا سنگین هستند و از فلزات محکم برای ساخت آن ها استفاده می شود. اگر سعی در بلند کردن آن ها داشته باشید متوجه می شوید که چه پایه های پهن و محکمی دارند. این قسمت ها در ثابت نگه داشتن و استحکام کلی میکروسکوپ نقشی موثر دارند. اگر این دستگاه به راحتی از جای خود تکان بخورد و ثبات کافی در بخش های مختلف آن وجود نداشته باشد، پژوهشگر هیچگاه نمی تواند به راحتی نمونه ها را مورد مطالعه قرار دهد.
میکروسکوپ فلوئورسنس – سلول های عصبی
وقتی با استفاده از یک میکروسکوپ، نمونه ای را مشاهده می کنید، کیفیت تصویر به یکی از فاکتورهای زیر وابسته است:
روشنایی: چقدر تصویر دریافتی روشن یا تیره است؟ میزان روشنایی وابسته به عملکرد و تنظیم صحیح واحدهای روشنایی است. می توانید لامپ قرار گرفته در منبع نور را تغییر داده یا حتی به سادگی میزان نور را کم و زیاد کنید. تنظیم کندانسور نیز برای دریافت نور مناسب اهمیت دارد.
فوکوس: اگر تصویر مات و بی کیفیت باشد، باید با استفاده از پیچ های تنظیم، استیج (که نمونه روی آن قرار گرفته) را اندکی بالا و پایین ببرید تا تصویر در فاصله کانونی مناسب قرار بگیرد. میزان ضخامت لامل (شیشه باریکی که روی نمونه قرار می گیرد) نیز در این زمینه نقشی مهم ایفا می کند.
رزولوشن: هرچه دیافراگم عددی لنزهای آبژکتیو بیشتر باشد، رزولوشن و وضوح تصویر نیز بهتر خواهد شد. طول موج نوری که از درون لنزها می گذرد نیز در نمایش رزولوشن مناسب اهمیت دارد.
کنتراست: کنتراست نیز وابسته به سیستم روشنایی است و با تغییر شدت نور می توان آن را کنترل کرد. مواد شیمیایی خاصی که به نمونه اضافه می شوند نیز کنتراست را دستخوش تغییر می کنند.
به ترتیب از راست به چپ: راینبرگ، زمینه تاریک، زمینه روشن – تصویر کنه زیر میکروسکوپ
مشکل بعدی مشاهده نمونه زیر میکروسکوپ آن است که تصاویر کنتراست کافی را ندارند؛ خصوصا اجزای زنده مثل سلول ها. اما رنگدانه های طبیعی که برای مثال درون برگ گیاهان دیده می شوند، کنتراست مناسبی را پدید می آورند.
یک راه برای بهبود کنتراست، رنگ آمیزی نمونه با مواد شیمیایی خاصی است که فقط روی بخش های خاصی از سلول تاثیر می گذارند. راه حل های مختلفی ابداع شده اند تا کنتراست را بهبود دهند. عمده تلاش ها در بخش سیستم روشنایی و نوع نوری که از حفره استیج می گذرد صورت گرفته.
برای مثال، یک میکروسکوپ زمینه تاریک از کندانسوری استفاده می کند که عمده نور تابیده شده را دفع کرده و صرفا بخش خاصی از روشنایی را به نمونه می تاباند و این پروسه را دقیقا همانند یک کسوف انجام می دهد.
میکروسکوپ های مختلف برای مطالعات متنوع کاربرد دارند که در زیر به شکلی کلی به آن ها اشاره می کنیم اما وارد جزئیات شان نمی شویم:
زمینه روشن: تقریبا عمده تصاویری که در کتاب ها و وبسایت ها مشاهده کرده اید، توسط میکروسکوپ های زمینه روشن گرفته شده اند. این تکنیک کنتراست بسیار اندکی دارد و برای مشاهده بهتر نمونه باید به رنگ آمیزی آن روی آورد.
زمینه تاریک: در این روش، همانطور که پیش تر ذکر شد، کندانسور میزان نور تابیده شده را کنترل می کند.
نورپردازی راینبرگ: نورپردازی راینبرگ تقریبا مشابه به روش زمینه تاریک است، اما با این تفاوت که طی این نورپردازی، یک سری فیلترهای خاص، رنگ آمیزی چشمی برای نمونه انجام می دهند، بدون آنکه واقعا رنگ آمیزی صورت پذیرد.
فاز کنتراست: این تکنیک بهترین راه مطالعه نمونه های زنده مثل سلول های کشت شده است. در یک میکروسکوپ فاز کنتراست، ابزارهایی حلقه مانند در لنزهای آبژکتیو و کندانسور، نور را به چند بخش تقسیم می کنند. نوری که از مرکز می گذرد، با نوری که از کناره های نمونه می گذرد ترکیب می شود و تصویری تاریک تر از پس زمینه پدید می آورد.
فاز کنتراست (سمت راست) و زمینه روشن (سمت چپ) – تصویر پارامسی زیر میکروسکوپ
دیفرانسیل کنتراست تداخل (DIC): روش DIC از فیلترهای قطبی و منشورها برای جداسازی و جمع آوری دوباره مسیرهای نوری استفاده می کند تا یک تصویر سه بعدی از نمونه ارائه دهد. روش DIC به نام نومارسکی، مخترع آن نیز شناخته می شود.
مدولاسیون کنتراست هافمن: این شیوه نیز مشابه روش نومارسکی است، با این تفاوت که پلیت های آن دارای شکاف های ریزی در محور موازی و عمود بر جهت تابش نور دارند. از این طریق نیز تصاویر سه بعدی پدید می آید.
پولاریزاسیون: این میکروسکوپ ها از دو پولاریزه کننده در دو جهت نمونه استفاده می کنند که عمود بر هم قرار گرفته اند. بنابراین فقط نوری که از نمونه می گذرد، به عدسی چشمی می رسد. نور در این حالت حین گذر از فیلترها پولاریزه می شود.
فلوئورسنس: این مدل میکروسکوپ ها از نورهای طول موج کوتاه و پر انرژی (معمولا فرابنفش) استفاده می کنند تا الکترون های موجود در مولکول های خاص را تحریک کرده و آن ها را به سطح بالاتری از مدار چرخشی خود ببرد. در این حالت مولکول ها تابشی خاص پیدا می کنند و تصویری حاصل می شود.
میکروسکوپ های نوری می توانند اجزای سلول زنده، بافت ها و حتی جزئیات چیزهای غیر زنده مثل یک تکه سنگ یا بخشی از خاک را به ما نشان دهند. ساده و پیشرفته، همه میکروسکوپ ها طی قرن های گذشته کمک بسیاری به بشر کرده اند و سطح دانش و بهداشت عمومی را بهبود بخشیده اند.
